科普文章

•T 细胞特异性删除 CD137 限制了肿瘤中CD8+ Tex细胞的存在

•NF- κB依赖性 CD137 信号传导刺激Tex细胞增殖和分化

•CD137 激活驱动Tex细胞基因的Tox依赖性表观遗传重塑

•随后的 CD137 刺激可提高抗 PD1 功效

概述

CD137 (4-1BB) 激活受体是一种有前景的癌症免疫治疗靶点。然而，CD137 驱动的细胞程序及其在癌症免疫监视中的作用尚不清晰。使用 T 细胞特异性缺失和激动抗体，作者发现 CD137 调节表达 PD1、Lag-3 和 Tim-3 抑制性受体的 CD8+ 耗竭 T ( Tex ) 细胞的肿瘤浸润。 T 细胞固有的、不依赖于 TCR 的 CD137 信号传导通过涉及RelA和cRel典型 NF- κB亚基和Tox依赖性染色质重塑的机制刺激Tex前体细胞的增殖和终末分化。虽然预防性 CD137 激动剂诱导的Tex细胞积聚有利于肿瘤生长，但在临床前小鼠模型中随后的 CD137 刺激可提高抗 PD1 功效。更好地了解 T 细胞耗竭对于癌症和传染病的治疗具有重要意义。作者的结果表明 CD137 是Tex细胞扩增和分化的关键调节因子，具有广泛的治疗应用潜力。 [1]

介绍

共抑制受体，例如 PD1、Tim3、Lag-3、TIGIT 和 CTLA-4 在驱动 CD8+ T 细胞低反应状态（称为 T 细胞耗竭）方面发挥着关键作用，这种状态在慢性病毒感染和癌症中经常观察到。尽管耗竭的 T ( Tex ) 细胞代表了一种独特的 T 细胞谱系，但“T 细胞耗竭”是一个通用术语，包括与效应 T 细胞功能障碍相关的各种不同的表观遗传和代谢状态。调节Tex细胞程序的转录因子 (TF)，包括Eomes 、TCF-1和高迁移率组 (HMG) 蛋白 Tox. 由于持续抗原暴露而延长的 T 细胞受体 (TCR) 信号传导似乎是慢性感染和癌症T 细胞中耗竭的主要原因。然而，作者对于可能参与影响Tex细胞分化的其他信号以及相应机制仍知之甚少。

针对T细胞耗竭来治疗癌症的策略已通过 PD1 和 CTLA-4阻断抗体的临床成功得以证明。 尽管如此，这些免疫检查点阻断剂 (ICB) 可能只能对于Tex细胞中具有祖细胞或干细胞特征的子集有效果，并且确实仅在一小部分癌症患者中观察到临床反应。因此，正在积极寻找提高 ICB 疗效的替代方案。当前大多数策略是探索其它抑制性受体，但实际上激活性受体也可能影响癌症免疫疗法的疗效。

CD137 (TNFRSF9, 4-1BB) 是肿瘤坏死因子受体 (TNFR) 超家族的共刺激成员，由活化的 T 细胞和其他细胞表达。表达在活化的树突状细胞 (DC)上的其天然配体 CD137L (4-1BBL, TNFSF9)可诱导 CD137 激活，从而增强 T 细胞增殖和细胞因子分泌，并保护 T 细胞免遭活化诱导的细胞死亡。CD137 刺激可扩大 CD8+ 效应记忆 T (Tem) 细胞，并促进不同小鼠模型中的肿瘤消退。因此，CD137 代表了一种有前景的癌症免疫治疗靶点。然而，抗 CD137单克隆抗体（例如urelumab）的功效有限，并且在早期临床试验中显示出肝毒性。此外，抗 CD137 激动剂的抗肿瘤与免疫调节活性的机制在很大程度上尚不清楚。事实上，抗 CD137 激动剂可减轻几种自身免疫小鼠模型的临床症状，表明 CD137 刺激可能会抑制免疫反应。因此，CD137 受体激活所驱动的细胞程序变化值得深入研究，以便更好地理解 CD137 信号传导的功能后果。在本项研究中，通过转录组、表观基因组和功能分析，作者证明了 T 细胞特异性 CD137 信号传导在 CD8+ T 细胞耗竭程序中的重要性。使用 T 细胞特异性 CD137 缺陷小鼠，作者发现 CD137 缺失限制了不同小鼠肿瘤模型中肿瘤相关的Tex细胞。 CD137 由 CD8+ Tex细胞特异性表达，CD137 激动剂促进这些细胞的TCR非依赖性、NF- κB依赖性增殖和终末分化。最后，虽然预防性抗 CD137 治疗诱导的Tex细胞积累有利于肿瘤逃逸，但作者发现随后的 CD137 刺激可提高 PD1 功效。

作者研究表明内源性地T细胞CD137信号通路激活是Tex细胞扩增和分化的重要组成部分，因此提出了关于 TCR 信号传导在此机制中的作用的问题。慢性 TCR 刺激即使不是唯一已知的，也是 CD8+ T 细胞耗竭的主要驱动因素。然而，使用 Nur77GFP TCR 报告基因、TCR 转基因 MHC-I 缺陷小鼠或钙调神经磷酸酶抑制剂进行的实验均表明CD137对于Tex细胞的促进作用是不依赖于 TCR / 钙调神经磷酸酶的。相反，研究结果揭示了RelA和cRel亚基在CD137 的Tex细胞诱导作用中的重要性，表明经典 NF- κB途径的激活可能有利于 CD8+ Tex细胞程序。该研究结果提出了一个问题：与 CD137 共享信号通路的其他 TNFR 成员是否也可能促进 T 细胞耗竭程序。然而，在后续的实验中，OX-40 和 GITR 激动剂都没有诱导衰竭相关标记，尽管这两种受体都像 CD137 一样促进 TRAF2 依赖性 NF- κB信号传导和存活。刺激Tex细胞扩增的CD137 信号传导有待后续研究继续完善。

但是，该研究结果并不排除 TCR 信号传导在 T 细胞耗竭中的作用。事实上，作者发现 CD137 刺激不会影响幼稚或 PD1− 记忆 CD8+ T 细胞，而是会扩展并促进已经呈现Tex样程序的细胞的终末分化。事实上，在人和小鼠的肿瘤和慢性感染组织中，流式细胞术和scRNA-seq分析都支持CD8+ T 细胞中的Tex细胞特异性表达 CD137。值得注意的是，对公共数据集的分析表明，Tnfrsf9表达仅限于慢性 LCMV 或肿瘤时产生的Tex细胞群，而不是急性 LCMV 感染中发现的真正效应记忆 CD8+ T 细胞。虽然慢性 TCR 信号传导可能是Tex细胞表达 CD137 的原因，但已确定了几种独立于TCR之外的机制，包括 IL-15 或 IL-2 以及 GITR都可诱导的非TCR依赖性的CD137表达。缺氧驱动的 Hif1α 也在肿瘤环境中诱导 CD137 表达。 TCR - CD137 的独立表达被认为有助于在缺乏特定抗原的情况下维持 CD8 Tmem细胞池。 作者的结果表明了类似的机制，即 CD8+ Tex细胞上的高 CD137 表达可能有助于其维持和扩增，即使在缺乏活跃的 TCR 信号传导的情况下。

很多科研团队，包括本研究作者所在实验室，均在不同动物肿瘤模型上证明了CD137激动剂抗体的抗肿瘤功能。尽管有充分的临床前研究证据，CD137激动剂抗体的临床疗效仍然有限。另外，临床试验还揭示了抗 CD137 mAb urelumab 的严重不良事件 (SAE)。抗 CD137 mAb诱导的效应功能有限的Tex细胞的系统性扩张可能是迄今为止令人失望临床表现的原因。事实上，作者发现用抗 CD137 mAb对小鼠进行预防性治疗随后增加了不同免疫原性肿瘤模型的生长，并限制了抗 PD1 免疫疗法的功效。与这些结果一致，抗 CD137 激动剂已被证明可以限制几种小鼠模型中的自身免疫性疾病。Tex细胞的全身扩张也可能是癌症患者中抗 CD137 诱导的 SAE 的原因。 事实上，老年患者有很长的感染史，可能含有更多的 CD8+ Tex细胞，这些细胞可能会扩增，并可能在全身 CD137 刺激后引起肝脏炎症。 这些结果强调了肿瘤内递送抗 CD137 mAb以限制旁观者Tex亚群全身激活风险的策略的重要性，尽管 TIL 的长期益处仍然是假设的。

T 细胞耗竭程序通常被认为是一种肿瘤逃逸机制，限制了 CD8+ T 细胞的抗肿瘤功能。事实上， Tex细胞的效应器功能降低，并表现出高水平的抑制性受体。然而， Tex细胞并不是惰性的，T 细胞耗竭在癌症和慢性传染病中可能并不总是不利的。事实上， Tex细胞具有残余功能，这在体内对于控制肿瘤生长和病毒复制可能很重要。例如，在猿猴免疫缺陷病毒 (SIV) 感染的慢性阶段， CD8+ Tex细胞的消耗导致病毒血症加剧。 在本研究中，作者发现与 WT 同行相比，CD137 缺陷小鼠中Tex细胞频率的降低减少了 CD8+ T 细胞浸润并增加了肿瘤生长。在缺乏 Tox 的情况下，慢性传染病中效应 T 细胞持久性也出现了类似的下降。因此， Tex细胞程序似乎可以确保慢性病原体或肿瘤控制，同时限制T细胞过分激活可能介导的免疫过激不良反应。维持和调控Tex细胞子集是最有前途的抗肿瘤策略之一。然而，预先存在的肿瘤特异性 T 细胞的重生能力可能有限，并且对抑制性检查点抗体有应答 T 细胞实际上可能源自最近进入肿瘤的 T 细胞的某个特定的克隆亚群。 在这种情况下，正如本研究中肿瘤小鼠模型所验证的，抗 CD137 激动剂对于Tex细胞的非TCR依赖性的扩增作用，可能有重要的临床应用价值，有望提高免疫检查点阻断剂 (ICB)功效。

研究结果

Tex细胞的肿瘤浸润

为了解决 CD137 在 CD8+ T 细胞抗肿瘤监视中的作用，作者将 Cd137fl/ fl小鼠与 Cd4cre 小鼠杂交，特别删除 T 细胞区室中的 CD137 表达。 Cd4CreCd137fl/ fl和 Cd137fl/ fl分别称为 Cd137−/− 和 Cd137+/+ 小鼠，皮下注射MC38结肠癌细胞或 B16K1 黑色素瘤细胞（图 1A），这是两种 CD8+ T 细胞依赖性免疫原性肿瘤模型。 24 ,25,26 CD137 缺陷导致 B16K1 和 MC38 小鼠模型中后期的肿瘤负荷更高，表明 CD137 的缺失会对 T 细胞抗肿瘤免疫反应产生负面影响（图 1A）。事实上，CD137 缺陷降低了这些肿瘤模型中 CD8+ 肿瘤浸润 T 淋巴细胞 (TIL) 的频率和数量（图 1B ）。与 Cd137+/+ 小鼠相比，Cd137−/− 小鼠中表达 PD1 和 Tim3 的 CD8+ TIL 减少，也观察到 B16K1 或 MC38-CD8+ TIL 表型差异（图 1C）。

图7 抗CD137对免疫监测和抗PD1疗效的对比研究

（A 和 B）用抗 CD137（10 μg ；3H3，腹膜内注射，每周两次）或对照 IgG 处理 C57BL/6 WT 小鼠指定的时间。实验设计 (A) 和肿瘤体积 (B)。 （n = 5/组）。

(C 和 D)从用抗 CD137 （100 μg ；3H3，腹膜内注射，每周两次）处理 18 天的OT-1 小鼠中进行 FACS 分选脾脏Tmem和Tex细胞，并转移至 Rag2−/−Il2rg−/− 小鼠中随后注射 B16-ova 肿瘤细胞。 (C) 实验设计。 (D) 指定小鼠组的肿瘤面积和存活率。 （n = 每组 5 只小鼠，来自一项实验。）

(E–G) C57BL/6 WT 小鼠注射 B16K1 (F) 或 B16-ova (G)，并从第 9 天开始用 IgG 对照、抗 CD137（10 μg；3H3，腹膜内注射。每周两次）进行治疗，抗 PD1（250 μg ip ., RMP1–14) 或两者。 (E) 实验设计。 (F 和 G) 指定小鼠组的肿瘤面积和存活率。 （n = 10–15/组）。除非另有说明，数据以至少 2 个独立实验的平均值±SEM 表示。每个符号代表一只单独的鼠标。 * p < 0.05; ** p < 0.01， ** p < 0.001（Mann-Whitney、Mantel-Cox 对数秩或采用 Tukey 检验后分析的方差分析） 。

图S7：抗CD137对免疫监测和抗PD1疗效的对比作用。

（A-C）用抗CD137（10µg；3H3，每周腹腔注射两次）或对照IgG治疗WT小鼠3周，并用B16F10（B）或Vk12653多发性骨髓瘤细胞（C）攻击。（A） 实验设计。（B） 肿瘤生长曲线（n=5/组）。（C） 恶性浆细胞（CD155）的频率和数量⁺CD138⁺). （n=12-15只小鼠/组，来自2个独立实验）。（D） 注射抗CD137（10µg；3H3，每周腹腔注射两次）或IgG对照18天的WT小鼠用B16K1攻击。小鼠在第6、9、12天用cIg（250µg i.p.）或抗PD1（250µgi.p.，RMP1-14）处理。所示小鼠组的肿瘤生长曲线。（n＝5/代表2个实验的组）。用B16K1或MC38细胞皮下注射（E-G）Cd4cre Cd137fl/fl（Cd137-/-）和Cd137fl/fil（Cd137+/+）。小鼠在第6、9、12天用cIg（200µg i.p.）或α-PD-1（200µgi.p.，RMP1-14）处理。实验设计（E）和所示小鼠组中的B16K1（F）或MC38（G）肿瘤生长曲线（n=5/代表2个实验的组）。数据以平均值±SEM表示，每个符号代表一只小鼠。多组之间的统计差异通过单因素方差分析确定，并对多项测试进行校正，两组之间的差异使用Mann-Whitney检验进行评估*p＜0.001。

  参考文献：

1. Pichler, A.C., et al., TCR-independent CD137 (4-1BB) signaling promotes CD8⁺-exhausted T cell proliferation and terminal differentiation. Immunity, 2023. 56(7): p. 1631-1648.e10.

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